安全性評估: 胚胎細胞急毒性試驗 ISO15088:2007

此試驗方法可適用於藍色標誌標準規範(bluesign® standard)評估生物毒性

水質、廢水對斑馬魚胚胎細胞(Danio rerio)急性毒性的測定
原文：請參照國際標準組織發佈之文件 ISO 15088:2007

斑馬魚卵作為實驗生物模型的獨特優勢：

  1. 體型小，易於飼養，減少飼養空間和管理成本。
  2. 產卵量大，每條雌魚一天可產卵幾百個，每2~3周可再產卵一次，保證了受測生物的來源和用量，能夠保證統計的要求。
  3. 魚卵是體外發育，魚卵試驗能夠在24孔盤或者在培養皿中進行，可直接觀察組織和器官的整個發育過程。
  4. 魚卵體積小，在進行毒理試驗時所需要藥量及耗材少、設備體積小。減少成本，便於操作。
  5. 魚卵試驗週期短，從受精卵開始魚卵能夠依靠自身的卵黃囊供給營養存活好幾天，並能清楚的看到畸形現象，能在一周內操作完成。

此外，使用早期發育中的魚卵細胞進行毒性測試，一般比斑馬魚幼體和成體更為敏感，研究結果可提供很好的理論依據。隨著目前試驗動物倫理學3R原則的倡導以及高通量測試的需求，也越來越傾向於採用細胞和魚卵的測試方法來替代。

國際標準組織ISO已經制訂和頒布了Water quality-Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio)（ISO 15088-2007），標準規定了廢水對斑馬魚魚卵細胞 48 小時內急性毒性測定的方法，提供用於陸域地面水體、地下水體、放流水、廢水、污水及環境、用藥對斑馬魚胚胎之生物急毒性檢測。

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採樣及收件

  1. 到現場收集:
    放流水使用採樣瓶採樣，收集約一公升的試驗水。
  2. 樣品寄送:
    1. 建議使用德國DURAN採樣瓶採樣，收集約一公升的試驗水。
    2. 請在瓶子上寫上收集日期和時間
    3. 避光運輸，2℃～8 ℃冷藏寄到本公司。請勿選擇星期五寄出。
  3. 收件地址:
    斑馬魚生物檢驗科技有限公司 收
    台灣 新北市林口區中湖48-12號附3
    服務電話 (02) 2602-3168

樣品運輸與保存標準(參照 ISO 5667-16)

  • 使用 1000 ml 及以上惰性材料製成的採樣瓶，滿瓶密封
    （採樣容器參照 ISO 5667-16，採樣過程參照HJ/T 91）
  • 2 ℃～8 ℃避光運輸和保存，不超過 48 h（ISO 5667-16）

受測樣品預處理

  • 溫度調整：受測樣品預處理: 低於-18 ℃保存的樣品，不超過 25 ℃解凍，或在 2 ℃～8 ℃冷藏過夜解凍（ISO 5667-16）
  • pH 調整：調整至 7.0±0.2
  • 溶解氧調整：溶解氧濃度不低於 4 mg/L（大約 50%飽和度），且不能過飽和。

稀釋水

  • 根據 ISO 7346-1 和 ISO 7346-2 中指定的標準稀釋水成分
    • 294.0 mg/L 氯化鈣 ( CaCl2·2H2O )
    • 123.3 mg/L 七水硫酸鎂 ( MgSO4·7H2O )
    • 63.0 mg/L 碳酸氫鈉 ( NaHCO3 )
    • 5.5 mg/L 氯化鉀 ( KCl )
  • 稀釋倍數：按照 1 倍、2 倍、3 倍、4 倍、6 倍、8 倍、12 倍、16 倍、24 倍和 32 倍，選擇稀釋濃度進行稀釋

養殖環境

  • 自來水經物理、化學、生物複合淨化處理（例如活性炭、RO反滲透膜等方法），自動養殖控制系統調節電導率至 300～500 µS/cm 後作為養殖水，用於種魚的飼育及維持。
  • 溶解氧飽和度應至少保持在 80%
  • pH 值介於 6.5～8.5
  • 溫度26 ℃±1 ℃
  • 光照：每天 16 h /8 h、14 h/10 h 或 12 h /12 h 的光/暗週期，可隨季節進行調整。光照強度 540 lux 左右。
  • 餵食活體豐年蝦或高產率的飼料，達到高產卵數量和受精卵的高品質要求。
  • 產卵後應分開飼養，恢復2~3週才能重新配對產卵。為保證每次魚卵的取得，應維持足夠數量的種魚。

試驗材料和方法(參照 ISO 15088:2007)

斑馬魚種魚條件

  • 野生型斑馬魚（Danio rerio）呈銀白色帶藍色水平條紋，成魚體長可達 3.5 cm 左右。
  • 使用健壯、無疾病、無畸形、產卵量及受精率高的野生型斑馬魚作為種魚用於產卵
  • 魚齡在6 月～24 月之間。
  • 健康母魚腹部銀亮，飽滿膨大。
  • 健康公魚體型修長，腹部扁平，身體帶有金黃色光澤。
  • 種魚在產卵前 6 個月不予使用任何藥物。

斑馬魚種魚配對

  • 在收集魚卵進行試驗的前一天傍晚，將產卵盒內盒套入外盒，插入隔板，加入約 2/3 缸標準稀釋水，選取體長及魚齡相當、健康活動力強的公母種魚，在左右兩個隔間中分別加入 1 尾母魚和 2 尾公魚，蓋上蓋板，於恆溫培養箱或恆溫室中26 ℃±1 ℃避光放置過夜。
  • 至少進行 3 組種魚的配種、產卵。

產卵及魚卵初篩選

  1. 次日光照開始後，打開產卵盒蓋板，抽開隔板，讓公母種魚交配產卵，30 min 後檢查各缸種魚產卵情況
  2. 分別收集已產卵各缸內相應魚卵，用標準稀釋水沖洗至9cm培養皿中，在恆溫培養箱或恆溫室中靜置 45 min 後，培養皿以黑色為底，側面加以燈光觀察，可快速顯微鏡鏡檢魚卵後，每個培養皿中隨機選取正常發育的魚卵

魚卵數量和時間(ISO15088:2007)

  • 每一個稀釋濃度試驗 10 個
  • 陰性對照組(NC) 10 個
  • 陽性對照組(PC) 10 個
  • 每一孔盤對照組 4 個
  • 暴露時間: 48小時

實驗48小時後，試驗結果品質控制驗證

  • 對照組魚卵不得死亡
  • 陰性對照水樣魚卵存活率≥90%
  • 陽性對照水樣魚卵死亡率＞10%。

 

結果判斷

實驗結束後，以下四個觀察結果中，任何一個結果出現即判定為急性毒性，並計算最低無效稀釋度(Lowest Tested value for D / LIDegg)值。

1. 胚胎凝結不生長

2. 體節構造發育不全

3.尾部從卵黃囊剝離不全

4. 心臟無跳動

結果

可由統計分析 (如：SPSS, grapher, prism) 計算出最低無效稀釋度(Lowest Tested value for D / LIDegg)值。

 

參考資料

參考資料

 

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